Coloration de Ziehl-Neelsen: Fond de teint, réactifs et technique

Coloration de Ziehl-Neelsen dans une technique de coloration pour identifier les microorganismes résistants aux alcools et aux acides (AAR). Le nom de cette procédure de microbiologie fait référence à ses auteurs: le bactériologiste Franz Ziehl et le pathologiste Friedrich Neelsen.

Cette technique est un type de coloration différentielle, qui implique l’utilisation de différents colorants afin de créer un contraste entre les structures que vous souhaitez observer, différencier et identifier plus tard. La coloration de Ziehl-Neelsen sert à identifier certains types de microorganismes.

Certains de ces microorganismes sont les mycobactéries (par exemple, Mycobacterium tuberculosis ), les nocardia (par exemple, Nocardia sp.) Et certains parasites unicellulaires (par exemple, Cryptosporidium parvum ). Beaucoup de bactéries peuvent être classées par une technique courante appelée coloration de Gram.

Cependant, certains groupes bactériens nécessitent d'autres méthodes pour les identifier. Des techniques telles que la coloration de Ziehl-Neelsen nécessitent des combinaisons de colorants avec de la chaleur pour fixer le premier à la paroi cellulaire.

Vient ensuite un processus de décoloration qui permet d'obtenir deux résultats: résistance ou sensibilité à la décoloration par les acides et les alcools.

Fondation

La base de cette technique de coloration est basée sur les propriétés de la paroi cellulaire de ces microorganismes. La paroi est formée par un type d’acides gras appelés acides mycoliques; Celles-ci se caractérisent par de très longues chaînes.

Lorsque les acides gras ont des structures très longues, ils peuvent retenir les colorants plus facilement. Certains genres de bactéries sont très difficiles à colorer en raison de la coloration de Gram, en raison de la teneur élevée en acide mycolique de la paroi cellulaire.

Dans la coloration de Ziehl-Neelsen, le composé phénolique carbol fuchsine, un colorant basique, est utilisé. Cela a la capacité d'interagir avec les acides gras de la paroi cellulaire, qui a une texture cireuse à la température ambiante.

La coloration au fuchsine au carbol est améliorée en présence de chaleur, car la cire fond et les molécules de colorant se déplacent plus rapidement dans la paroi cellulaire.

L'acide utilisé par la suite sert à décolorer les cellules qui n'ont pas été colorées car leur paroi n'était pas suffisamment liée au colorant; par conséquent, la force du décolorant acide est capable d'éliminer le colorant acide. Les cellules qui résistent à cette décoloration sont appelées résistantes aux acides.

Coloration secondaire

Après la décoloration de l'échantillon, cela contraste avec un autre colorant appelé colorant secondaire. Le bleu de méthylène ou le vert de malachite sont généralement utilisés.

Le colorant secondaire souille le matériau de base et, par conséquent, crée un contraste avec les structures teintes lors de la première étape. Seules les cellules blanchies absorbent le deuxième colorant (anti-coloration) et prennent leur couleur, tandis que les cellules acido-résistantes conservent la couleur rouge.

Cette procédure est fréquemment utilisée pour identifier Mycobacterium tuberculosis et Mycobacterium leprae, appelés bacilles acido-résistants.

Réactifs

Coloration primaire

De la carboxine à 0, 3% de fuchsine (filtrée) est utilisée. Ce colorant est préparé à partir d'un mélange d'alcools: phénol dans de l'éthanol (90%) ou du méthanol (95%). Dans ce mélange, 3 grammes de fuchsine basique sont dissous.

Solution décolorante

Dans cette étape, des solutions d'acide alcool à 3% ou d'acide sulfurique à 25% peuvent être utilisées.

Coloration secondaire (anti-colorant)

Le colorant le plus couramment utilisé pour effectuer le contraste dans les échantillons est généralement de 0, 3% de bleu de méthylène. Cependant, d'autres peuvent également être utilisés, tels que 0, 5% de vert malachite.

Technique

Procédure de coloration acide-rapide

Préparer un frottis bactérien

Cette préparation est effectuée sur une lame propre et sèche, en respectant les précautions de stérilité.

Sécher le frottis

Laisser sécher le frottis à la température ambiante.

Chauffer l'échantillon

L'échantillon doit être chauffé en appliquant un feu sur la lame ci-dessous. Une fixation avec de l'alcool peut être réalisée lorsque le frottis n'a pas été préparé avec du crachat (traité avec de l'hypochlorite de sodium pour le blanchir) et s'il ne va pas être coloré immédiatement.

M. tuberculosis est éliminé avec de l’eau de Javel et au cours du processus de coloration. La thermofixation des expectorations non traitées ne tue pas M. tuberculosis, tandis que la fixation à l'alcool est bactéricide.

Couvrir la tache

La tache est recouverte de la solution de fuchsine de carbol (tache de base primaire).

Chauffer la tache

Ceci est fait pendant 5 minutes. Vous devriez remarquer une libération de vapeur (environ 60 ° C). Il est important de ne pas surchauffer et d'éviter de brûler l'échantillon.

En ce qui concerne le réchauffement de la tache, le carbol-fuchsine doit être chauffé avec une grande prudence, surtout si la coloration est effectuée sur un plateau ou un autre récipient dans lequel des produits chimiques hautement inflammables ont été recueillis à partir de la tache précédente.

Appliquez une petite flamme sous les lames à l'aide d'un coton-tige éclairé préalablement humidifié avec quelques gouttes d'alcool acide, de méthanol ou d'éthanol à 70%. Évitez d'utiliser un grand coton-tige imbibé d'éthanol, car cela présente un risque d'incendie.

Laver la tache

Ce lavage devrait être fait avec de l'eau propre. Si l'eau du robinet n'est pas propre, lavez le frottis avec de l'eau filtrée ou distillée, de préférence.

Couvrir le frottis avec de l'alcool acide

Cet alcool acide devrait être à 3%. La couverture est réalisée pendant 5 minutes ou jusqu'à ce que le frottis soit suffisamment décoloré, c'est-à-dire rose pâle.

Il faut tenir compte du fait que l’alcool acide est inflammable; par conséquent, il doit être utilisé très soigneusement. Évitez de vous trouver à proximité de sources d'inflammation.

Laver la tache

Le lavage doit se faire avec de l’eau distillée propre.

Couvrir le frottis avec du colorant

Il peut s'agir d'un colorant malachite vert (0, 5%) ou bleu de méthylène (0, 3%) pendant 1 ou 2 minutes, en utilisant le temps le plus long si le frottis est fin.

Laver la tache

De l'eau propre doit être réutilisée (distillée).

Égoutter

Le dos de la lame doit être nettoyé et la tache doit être placée sur une étagère de drainage afin qu'elle sèche à l'air (n'utilisez pas de papier absorbant pour le séchage).

Examiner le frottis au microscope

L'objectif 100X et l'huile d'immersion doivent être utilisés. Scannez systématiquement le frottis et notez les observations pertinentes.

Interpréter les résultats

Théoriquement, les micro-organismes teints d'une couleur rougeâtre sont considérés comme positifs à l'acide (AAR +).

Au contraire, si les micro-organismes sont colorés en bleu ou en vert, selon le colorant utilisé en tant que contre-colorant, ils sont considérés comme un acide négatif résistant à l'alcool (AAR-).